Лекция для врачей "ЭКО. Улучшенный отбор эмбрионов. Технология покадровой съемки" (отрывок из книги "Атлас эмбриологии. Последовательные покадровые изображения" - Кэмпбел А., Фишела С.)
Клинические аспекты замедленной покадровой съемки
Введение
Морфологическая оценка эмбрионов, полученных с помощью ЭКО, широко применяется в клинической практике и является единственным критерием выбора пригодных для переноса эмбрионов. Корреляция морфологии эмбриона с потенциалом имплантации была подтверждена многочисленными исследованиями.
Как правило, морфологическую оценку эмбрионов проводят каждый день в течение 5-6 дней развития эмбриона in vitro до стадии бластоцисты путем однократных, строго запланированных по времени наблюдений. Несмотря на то что выбор эмбриона(ов) для переноса принято делать на основании морфологии эмбриона непосредственно перед переносом, другие особенности его развития также характеризуют его потенциал. Оценка количества клеток и процента фрагментации эмбрионов на разных этапах развития легла в основу простых систем классификации, одна из которых используется в Великобритании. В других системах классификации используется более комплексный подход к оценке качества эмбрионов, учитывающий дополнительные параметры, например морфологию пронуклеусов. Не так давно на конференции по согласованию единых стандартов оценки эмбрионов в Стамбуле была разработана общая терминология и описаны критерии морфологической оценки ооцитов и эмбрионов, обеспечивающие эффективное сравнение результатов и стандартизацию отчетности.
Эта система классификации, основанная на клинических данных, связывает морфологические параметры эмбриона на разных этапах развития с его жизнеспособностью.
Тем не менее точное определение жизнеспособных эмбрионов из когорты на основе только морфологических параметров не представляется возможным, и это неизбежно снижает вероятность положительного исхода в программах ЭКО. Непреднамеренный выбор непригодного эмбриона и криоконсервация перспективного задерживают получение желаемого результата. Множество данных свидетельствует в пользу того, что отбору эмбрионов, проявляющих оптимальные морфокинетические характеристики, следует уделять больше внимания. Однако оценить морфокинетику (морфологию и скорость прохождения эмбрионом различных этапов преимплантационного развития) невозможно при стандартной инкубации и статичном морфологическом исследовании эмбрионов. Кратковременные наблюдения, традиционно используемые для уменьшения стресса от воздействия окружающей среды на эмбрионы, не дают полной информации о показателях или особенностях развития эмбрионов.
Согласно нескольким отчетам, использование замедленной покадровой съемки как клинического инструмента для анализа серийных изображений эмбрионов в процессе их развития улучшает отбор эмбрионов. Устройства для покадровой съемки, доступные в настоящее время, позволяют фиксировать изображения эмбрионов, развивающихся in vitro, через определенные промежутки времени в течение всего периода культивирования. Продолжительное и непрерывное наблюдение - более совершенный инструмент для изучения и селекции преимплантационных эмбрионов, чем обычная ежедневная микроскопия. Первым прибором, обеспечивающим стабильную непрерывную инкубацию в сочетании с микроскопией, был EmbryoScope. M. Meseguer и соавт. отмечали, что стабильные условия культивирования и использование этой системы для оценки морфокинетических параметров и выбора эмбрионов на 20% увеличивали частоту наступления беременности по сравнению со стандартной инкубацией. Кроме того, технология timelaps позволяет выявить атипичное дробление эмбрионов, которое невозможно обнаружить с помощью традиционных статических методов. Примером атипичного дробления, которое, по некоторым данным, наблюдается достаточно часто, является прямое или быстрое расщепление зиготы на три клетки менее чем за 5 ч.6 Исследование показало, что замедленная покадровая съемка позволяет идентифицировать аномально дробящиеся эмбрионы, которые имеют сниженный потенциал имплантации. В когорте из 1659 перенесенных эмбрионов частота прямого деления на 3 бластомера составила 13,7%, а частота имплантации таких эмбрионов была значительно ниже, чем у эмбрионов с нормальной картиной дробления (1,2 и 20,2% соответственно). Важно отметить, что это относительно распространенное, но клинически патологическое дробление не было обнаружено до появления технологии покадровой визуализации.
Существует множество приложений для обработки timelaps-изображений в соответствии с нуждами лаборатории ЭКО. Они позволяют судить об эффективности традиционных методов статического анализа, прогнозировать жизнеспособность эмбрионов, рассчитывать исходы лечения и оценивать влияние внешних факторов (таких как среда для культивирования или режим стимуляции), отмечать переходные или патологические морфологические признаки, контролировать качество и оптимизировать рабочие протоколы. В этой главе мы рассмотрим практические аспекты получения серийных изображений с помощью замедленной покадровой съемки, использования морфо-кинетических данных для разработки алгоритмов выбора эмбриона и обсудим, как покадровая съемка может помочь стандартизировать данные оценки эмбрионов и улучшить результаты лечения пациентов в клиниках ЭКО.
Выбор и исключение морфокинетических критериев
Наблюдение процесса развития в сочетании с традиционной оценкой морфологии дает исчерпывающую информацию о морфокинетике каждого эмбриона. Материалы, собранные в режиме ручной или автоматической записи изображений через заданные промежутки времени, можно ретроспективно проанализировать и получить сведения об исходе лечения (бластуляции, имплантации, генетическом статусе или родах). Ретроспективный анализ позволяет практикующим специалистам выбирать перспективные и предпочтительные критерии отбора эмбрионов для переноса или криоконсервации.
Замедленную покадровую съемку также целесообразно использовать для поиска исключающих, или отрицательных, критериев развития. Например, если было установлено, что морфокинетическая переменная или событие исключает имплантацию либо связано с другим неблагоприятным клиническим исходом, эмбрионы, проявляющие такое качество, могут быть исключены из числа эмбрионов для переноса независимо от их традиционной морфологи-ческой оценки.
Обработка данных
Морфокинетические данные систем покадровой съемки необходимо группировать в соответствии с результатом переноса эмбрионов, что позволит сравнивать результаты и проводить статистический анализ. С особой тщательностью следует исключать из анализа данные о переносах нескольких эмбрионов, в результате которых развивающихся беременностей и рожденных детей было меньше, чем перенесенных эмбрионов. Аналогично, если после переноса двух эмбрионов возникла беременность двумя плодами, включать в анализ данные таких переносов недопустимо без генетического тестирования, пока не будет точно определено, от одной или нескольких зигот произошла беременность. Из-за широкой вариабельности, характерной для морфокинетических переменных, чтобы избежать искажения результатов при сравнении успешных и неуспешных групп эмбрионов, рекомендуется использовать значение медианы, а не среднее. Как только ключевые значения переменных определены в зависимости от статистической силы имеющихся данных, их можно классифицировать исходя из того, как они связаны с исходом. Это помогает разрабатывать модели и алгоритмы селекции эмбрионов.
Алгоритмы выбора эмбрионов
Биомаркеры, отражающие качество эмбрионов (например, раннее деление на две клетки, наличие агрегатов гЭПР), уже давно применяются в клиниках ЭКО для принятия решения о том, какой эмбрион следует переносить или криоконсервировать, но эта практика имеет ограничения из-за статичности наблюдений и, часто, неустойчивого характера маркеров. Тем не менее эмбриологи могут использовать существующие критерии отбора и в то же время накапливать данные и опыт работы с нововведенной системой замедленной покадровой съемки, постепенно разрабатывая индивидуальную, специфическую систему отбора. Например, вместо того чтобы ориентироваться на время первого деления, соответствующее 25±1 чпи, как рекомендуется в руководствах по оценке эмбрионов, можно оперировать более точным значением, рассчитанным на основе исходов лечения, возможно, учитывая метод инсеминации или индивидуальные особенности пациента. Затем уточненный параметр можно включить в модель отбора эмбрионов.
Первая морфокинетическая модель для отбора эмбрионов, которые с большой вероятностью продолжат развитие до стадии бластоцисты, основывалась на оценке времени прохождения этапов дробления и была опубликована C. C. Wong и соавт. в 2010 г. С тех пор прогнозирование бластуляции как показателя качества эмбрионов, или жизнеспособности, было заменено более надежными клиническими показателями результативности, такими как хромосомный набор эмбриона, потенциал имплантации и успешные роды.
M.Meseguer и соавт. использовали иерархический подход к моделированию, при котором классификация эмбрионов основывалась главным образом на ключевых этапах развития и связанных с ними отрезках времени. При ретроспективном анализе более 500 перенесенных эмбрионов (данные по имплантации были доступны для 247) исследователи обнаружили существенные различия по шести ранним морфокинетическим переменным между эмбрионами, которые имплантировались и не имплантировались. Согласно полученным данным, наиболее значимыми параметрами для прогнозирования успеха имплантации были время, за которое эмбрион достигал 5-клеточной стадии (t5), и продолжительность второго клеточного цикла (сс2; от англ, cell cycle). Модель M. Meseguer и соавт. также включала три исключающих критерия, основанных на их отрицательной связи с имплантацией. Этими критериями были прямое деление на три бластомера, неравный размер и многоядерность бластомеров на стадии четырех клеток. Позднее A.Campbell и соавт. рассмотрели вопрос о том, существует ли разница в морфокинетике эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов, на основе данных, полученных после биопсии бластоцист и преимплантационного генетического скрининга. Среди более чем 20 сопоставленных параметров статистически значимую связь имели значения времени начала бластуляции (tSB) и достижения стадии полной бластоцисты (tB), определяемые в соответствии с их системой аннотаций. Исходя из этого, используя пошаговое разделение (структурирование), они представили модель классификации рисков анеуплоидии. Недавно N. Basile и соавт. предложили модель для повышения вероятности выбора эуплоидного эмбриона из когорты, основанную на логистической регрессии, используя морфокинетические данные эмбрионов после биопсии бластомера и преимплантационного генетического скрининга. Они сообщили, что хромосомно сбалансированные и несбалансированные эмбрионы проявляли разные кинетические особенности. Статистически значимыми морфокинетическими переменными в их модели были время дробления от 2 до 5 клеток (t5—12) и продолжительность третьего клеточного цикла (ссЗ = t5—13). Несмотря на то что эуплоидность имеет решающее значение для рождения здорового ребенка, очевидно, что существует множество других эмбриональных и материнских факторов, важных для имплантации и развития эмбриона. По этой причине рождение здорового ребенка, а не плоидность является конечной мерой благоприятного исхода лечения. Именно рождение ребенка использовалось в качестве определяющего критерия в мультипликативной модели раннего отбора дробящихся эмбрионов. В этой модели ключевые переменные и интервалы времени оценивались с точки зрения способности прогнозировать живорождение, что позволило бы использовать их для ранжирования эмбрионов. При сравнении морфокинетических профилей между эмбрионами, которые приводили или не приводили к родам, была найдена достоверная связь с продолжительностью первого деления и первых клеточных циклов. Хотя исследование было выполнено на небольшой выборке, это очень многообещающая модель, так как она показала высокую точность классификации эмбрионов относительно вероятности живорождения (площадь под кривой, показывающей связь чувствительности и специфичности, составила 0,8).
Несмотря на то что к настоящему времени было описано несколько моделей для выбора эмбрионов, основанных на морфокинетике эмбрионов, следует отметить, что эти модели нельзя перенести в другую клиническую лабораторию без каких-либо изменений. Проблема воспроизводимости модели в другой обстановке обусловлена набором факторов, первым из которых является среда для культивирования. Например, сообщалось, что парциальное давление инкубационного газа или среды влияет на морфокинетику эмбрионов наряду с возрастом пациентов или индексом массы тела. Недавно было показано, что описанную выше многовариантную иерархическую модель выбора эмбрионов нельзя перенести без изменений из одной клинической лаборатории в другую. Напротив, модель классификации риска анеуплоидии и прогнозирования имплантации, также упомянутая выше, была успешно протестирована на больших независимых массивах данных. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, какие события наиболее важны в развитии эмбриона и могут служить надежными критериями отбора: до активации эмбрионального генома (морфокинетика дробления до 8-клеточной стадии) или более поздняя морфокинетика, отражающая активацию эмбрионального генома. Большинство работ, опубликованных до настоящего времени, были сфокусированы на особенностях дробления эмбриона до 5-клеточной стадии для прогнозирования бластуляции или им-плантации, а не на рождении детей. Наряду с влиянием материнских факторов на имплантацию жизнеспособных эмбрионов, а также анеуплоидии как самой крупной и достоверной причины неудачи «золотым стандартом» оценки исхода лечения должно быть рождение детей. Хотя некоторые из перечисленных параметров более удобны для интерпретации и, возможно, являются более объективными, они могут быть не столь показательными для оценки длительного развития эмбриона и его потенциала после активации эмбрионального генома.
Необходимость консенсуса
В настоящее время не существует единых рекомендаций для специалистов, работающих с замедленной покадровой съемкой в ЭКО. Наряду с учебными семинарами и форумами, которые часто проводят поставщики устройств, у эмбриологов и исследователей существует множество возможностей, чтобы обсуждать и сравнивать оптимальные методы работы. По мере увеличения доли циклов ЭКО, использующих замедленную покадровую съемку, все более приоритетной задачей становится разработка профессиональных рекомендаций для определения, интерпретации и аннотирования изображений. Аннотации представляют собой регистры морфологических и динамических явлений, которые служат основой для индивидуальной оценки и классификации эмбрионов. Единообразие аннотаций, используемых в клинике и в этой области медицины в целом, позволит унифицировать морфокинетическую оценку эмбрионов.
Процесс принятия единой морфокинетической системы выбора эмбрионов обещает быть сложным. Это обусловлено большой неоднородностью опубликованных исследований, посвященных замедленной покадровой съемке, а также отсутствием проспективных рандомизированных контролируемых исследований для полной поддержки концепции. Многие клиники испытывают трудности с набором пациентов для подобных исследований, в связи с чем этот классический критерий научной обоснованности данных не позволяет быстро прийти к общему мнению о морфокинетической системе выбора эмбрионов. Тем не менее такая система чрезвычайно важна, поскольку дает возможность разработать единые принципы аннотирования изображений и терминологию для описания морфокинетических переменных.
Стороннее мнение и подготовка персонала
Одним из ключевых преимуществ использования систем покадровой съемки в лаборатории ЭКО является возможность перемотать, остановить, а также пересмотреть отдельные кадры, чтобы изучить детали и сопутствующие факторы развития эмбриона, не нарушая условий его культивирования. Хранение изображений также позволяет ретроспективно пересматривать их для повторного аннотирования особенностей развития и, возможно, обозначения новых событий, которые ранее остались не описанными (как было отмечено в данном атласе). Кроме того (и это особенно ценно), можно аннотировать дополнительные переменные (например, только для эмбрионов с известными исходами). Такие возможности имеют большое клиническое значение, поскольку помогают находить морфокинетические биомаркеры, коррелирующие с рождением детей.
Контроль и гарантии качества
Эффективность работы лаборатории повышается, когда стандартные манипуляции могут выполнять сразу несколько сотрудников. Серийная покадровая съемка не является исключением, и с введением ее в лабораторную практику просмотр, аннотирование и интерпретация изображений стали рутинными операциями. Там, где задействовано несколько практикующих эмбриологов, риск субъективности и непоследовательности выше, хотя вариации аннотирования могут быть присущи и одному оператору. Для получения максимально точного и объективного отчета о динамичном, часто аномальном, развитии эмбриона необходимо делать непростой выбор между использованием автоматических программ и индивидуальных или коллективных ручных методов аннотирования. Чтобы свести к минимуму субъективность, ключевые переменные для аннотирования рекомендуется определять в стандартном операционном протоколе и регулярно их регистрировать. Поскольку в настоящее время отсутствуют единые рекомендации, стратегию следует разрабатывать в каждой конкретной лаборатории, а затем соблюдать, контролировать и при необходимости уточнять. Основные морфокинетические переменные должны определять и аннотировать опытные специалисты, прошедшие особую подготовку. Некоторые морфокинетические переменные в большей степени подвержены риску субъективной интерпретации, чем другие (например, появление пронуклеусов). Для обеспечения качества аннотирования полезно использовать эталонные изображения.
Наиболее часто регистрируемые морфокинетические переменные соответствуют основным параметрам раннего развития и дробления и включают в себя хронологию появления и исчезновения пронуклеусов, увеличение числа клеток (время до 2, 3, 4, 5, 6 клеток и т.д.), время достижения эмбрионом стадии морулы и бластоцисты. Далее можно вычислить длительность митотических циклов и их синхронность. Кроме того, конкретные аномалии или связанные с ними явления могут быть аннотированы в зависимости от возможностей настройки системы timelaps.
Чтобы поддерживать высокое качество данных, важно регулярно контролировать процесс составления аннотаций, а также их качество и соблюдение стандартного операционного протокола. Это позволит анализировать и выявлять достоверные положительные или отрицательные морфокинетические признаки.
Полученные к настоящему времени результаты свидетельствуют, что многие морфокинетические события регистрируются объективно, но для обеспечения качества крайне важны регулярные аттестации и проверки. L. Sundvall и соавт. с помощью коэффициента внутригрупповой корреляции рассмотрели различия между аннотациями, составленными несколькими операторами, и аннотациями, сделанными одним оператором. Их исследование установило соответствие данных, полученных опытными и новыми пользователями системы timelaps, для большинства морфокинетических переменных, однако показало, что некоторые статические морфологические параметры (такие как многоядерность и равные размеры бластомеров) остаются под угрозой субъективной оценки. Ее можно свести к минимуму при соответствующем контроле и наличии четких определений в стандартном операционном протоколе. В другой работе также обнаружено соответствие результатов, полученных разными операторами, но было показано, как одна неправильная аннотация может исказить результат анализа. Таким образом, до тех пор пока мы не узнаем, как небольшие отклонения от протокола влияют на результат, культуральные чашки и слайды следует подготавливать стандартным способом, а при ручном аннотировании timelaps-изображений все специалисты должны быть максимально объективными.
Перспективы развития
Быстрое развитие и внедрение в практику технологии замедленной покадровой съемки неизбежно. Этому способствует большой интерес к данной технологии профессионалов в области ЭКО, многообещающие клинические результаты, возможность расширить знания врачей и пациентов о развитии эмбриона перед имплантацией и его визуальных особенностях.
Для поддержки новых приложений (таких как интерфейс пациента, улучшенный сбор данных, хранение, совместное использование и удаленный доступ) вместо автономных устройств необходимы компьютерные серверы.
Сервер Zoi (FertiliTech, Дания) является платформой, которая поддерживает безопасный обмен данными внутри клиник, использующих EmbryoScope, и между ними. Данные пациента можно собрать из нескольких связанных инкубаторов и объединить в общем хранилище. Это позволяет специалистам просматривать, аннотировать и выбирать эмбрионы удаленно, что открывает новые возможности для повышения производительности и гибкости. В скором времени также ожидается появление статистических пакетов программного обеспечения, которые позволят контролировать качество и подробно анализировать данные, связанные с построением модели выбора эмбрионов.
Заключение
В этой быстро развивающейся и весьма перспективной области репродуктивной медицины у практикующих специалистов теперь есть дополнительный, становящийся все более надежным инструмент, позволяющий улучшить отбор эмбрионов. Пока неясно, какие пациенты получат наибольшую пользу (значительное повышение вероятности беременности и родов) от этого нового подхода. Чтобы доказать его эффективность, необходимы крупные рандомизированные контролируемые исследования. Но поскольку важно вовремя обнаружить нарушения преимплантационного развития эмбриона, имеет смысл вместо статического метода одномоментной фиксации использовать технологию, которая дает возможность изучать весь процесс в динамике. Чем больше вопросов мы задаем при сопоставлении изображений и обзоре данных, тем больше можем узнать об оптимальном морфокинетическом профиле. Timelaps-технология обладает потенциалом для разработки алгоритмов выбора эмбрионов. Это позволяет определять многочисленные критерии для различных обстоятельств - от индивидуальных особенностей пациента до усредненных условий в лаборатории. Со временем можно будет уточнить оптимальные диапазоны для определенных динамических явлений, которые непосредственно связаны с «нормальным» клеточным циклом, а также выявить новые морфокинетические маркеры жизнеспособности эмбриона.
Замедленная покадровая съемка является инструментом, который не только значительно повышает гибкость протоколов в клинике ЭКО, но также обладает потенциалом для обучения, отработки практических навыков и, самое главное, улучшения клинических результатов.
Вы читали отрывок из книги "Атлас эмбриологии. Последовательные покадровые изображения" - Кэмпбел А.
Книга "Атлас эмбриологии. Последовательные покадровые изображения"
Авторы: Кэмпбел А., Фишела С.
Атлас представляет собой первое в своем роде издание, посвященное новому методу мониторинга и отбора эмбрионов, который выводит современную науку на новый уровень понимания процессов развития. В книге вводятся общие понятия покадровой визуализации, описываются используемые устройства и методы, а также рассматриваются изменения, происходящие в ходе развития in vitro. В каждом разделе атласа содержатся как опубликованные, так и новые расчеты и наблюдения, сделанные с помощью замедленной покадровой съемки. Они сопровождаются последовательными изображениями и описаниями клинических примеров из выборки, насчитывающей свыше 9000 преимплантационных эмбрионов человека. Атлас завершается обзором мнений пациентов, проходящих лечение с помощью ЭКО, об использовании метода замедленной покадровой съемки, который позволяет им наблюдать за развитием их будущих детей. Атлас будет полезен эмбриологам, желающим расширить свои познания о развитии человеческого эмбриона перед имплантацией, а также всем специалистам, занимающимся ЭКО и желающим внедрить эту перспективную технологию в свою практику.
Содержание книги "Атлас эмбриологии. Последовательные покадровые изображения" - Кэмпбел А.
1. Оборудование, необходимое для замедленной покадровой съемки при экстракорпоральном оплодотворении
2. Клинические аспекты замедленной покадровой съемки
3. Покадровая съемка, клеточный цикл, распределение морфокинетических этапов во времени и данные с известной имплантацией
4. Пол эмбриона и морфокинетические параметры
5. Выделение полярного тельца
6. Оплодотворение: образование и исчезновение пронуклеусов
7. Клинические данные: динамические особенности – фрагментация
8. Количество пронуклеусов и плоидность эмбрионов, полученных в результате ЭКО/ИКСИ
9. Динамические особенности: компактизация
10. Бластуляция
11. Вылупление (хэтчинг) человеческой бластоцисты
12. Нарушения дробления
13. Обратное дробление/слияние бластомеров
14. Агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума
15. Многоядерность
16. Вакуолизация
17. Зернистость цитоплазмы
18. Дефекты блестящей оболочки
19. Мнение пациентов
Примеры страниц из книги "Атлас эмбриологии. Последовательные покадровые изображения" - Кэмпбел А.
